Pseudoperonospora cubensis and P. humuli detection using species-specific probes and high definition melt curve analysis

Real-time PCR assays using locked nucleic acid (LNA) probes and high resolution melt (HRM) analysis were developed for molecular differentiation of Pseudoperonospora cubensis and P. humuli, causal agents of cucurbit and hop downy mildew, respectively. The assays were based on a previously identified single nucleotide polymorphism (SNP) in the cytochrome oxidase subunit II (cox2) gene that differentiates the two species. Sequencing of the same region from 15 P. cubensis isolates collected in New York State for the current study confirmed that all isolates shared the conserved SNP. LNA probes were specific and sensitive, detecting as few as 10 sporangia for both species and as little as 1fg P. cubensis total DNA and 10fg P. humuli total DNA. The LNA assay detected both pathogens from air sampled using spore traps placed in vegetable fields and a hop yard during the summers of 2013 and 2014 and correctly diagnosed symptomatic leaf tissue. High resolution melt analysis (HRM) correctly identified all tested isolates as well as those isolates from symptomatic plants collected in the field. The LNA and HRM assays correctly identified both organisms when tested independently in a second laboratory. The results confirm that the LNA and HRM assays developed can provide reliable identification of both species despite the high molecular similarity of the cox2 gene. ResumeDes tests bases sur la PCR en temps reel avec amorces contenant des acides nucleiques bloques (LNA) et une analyse des courbes de fusion a haute resolution (HRM) ont ete concus en vue de la differenciation moleculaire de Pseudoperonospora cubensis et de P. humuli, agents causals du mildiou chez les cucurbitacees et le houblon, respectivement. Les tests etaient bases sur un polymorphisme mononucleotidique (SNP) prealablement identifie dans le gene de la sous-unite II de la cytochrome oxydase (cox2) qui differencie les deux especes. Le sequencage de la meme region de 15 isolats de P. cubensis, collectes dans l'Etat de New York pour l'etude en cours, a confirme que tous les isolats partageaient le SNP conserve. Les amorces de LNA etaient specifiques et sensibles, detectant aussi peu que 10 sporanges pour les deux especes et a peine 1 fg d'ADN total chez P. cubensis et 10 fg d'ADN total chez P. humuli. Le test avec amorces de LNA a permis de detecter les deux agents pathogenes dans l'air echantillonne des pieges a spores places dans des champs de legumes et dans une houblonniere durant les etes de 2013 et de 2014, et de correctement diagnostiquer les tissus foliaires symptomatiques. L'analyse des courbes de fusion a haute resolution a permis d'identifier correctement tous les isolats testes de meme que ceux provenant de plantes symptomatiques collectees sur le terrain. Les tests avec amorces de LNA et bases sur l'analyse des HRM ont permis d'identifier correctement les deux organismes lorsqu'ils ont tete analyses separement dans un deuxieme laboratoire. Les resultats confirment que les tests avec amorces de LNA et ceux bases sur l'analyse des HRM nouvellement concus peuvent permettre d'identifier precisement les deux especes malgre la forte similarite moleculaire du gene de la cox2.